skp2

Jun 19, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 805 (2023) Citar este artículo

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El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es el tipo de cáncer más prevalente y la principal causa de muerte relacionada con el cáncer. La resistencia a la quimioterapia es un obstáculo importante en el tratamiento de pacientes con NSCLC. Aquí, descubrimos que la ligasa E3 Skp2 está sobreexpresada, acompañada por la regulación negativa del regulador MLKL relacionado con la necroptosis en tejidos y líneas celulares de NSCLC humano. La eliminación de Skp2 inhibió la viabilidad, el crecimiento independiente del anclaje y el desarrollo de tumores in vivo de células NSCLC. También encontramos que la proteína Skp2 se correlaciona negativamente con MLKL en tejidos de NSCLC. Además, Skp2 aumenta y se acompaña de una regulación positiva de la ubiquitinación y degradación de MLKL en células de NSCLC resistentes al cisplatino. En consecuencia, la inhibición de Skp2 restaura parcialmente MLKL y sensibiliza las células de NSCLC al cisplatino in vitro e in vivo. Mecánicamente, Skp2 interactúa y promueve la degradación de MLKL mediada por ubiquitinación en células de NSCLC resistentes al cisplatino. Nuestros resultados proporcionan evidencia de un mecanismo dependiente de Skp2 que regula la degradación de MLKL y la resistencia al cisplatino, lo que sugiere que atacar la degradación de MLKL ubiquitinado por Skp2 puede superar la quimiorresistencia del NSCLC.

El cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que contiene tres subtipos histológicos principales: adenocarcinoma de pulmón (LUAD), carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) y carcinoma de células grandes, representa alrededor del 80-85 % del cáncer de pulmón1 y es una de las principales causas de cáncer de pulmón. Muertes por cáncer en todo el mundo2. Se han detectado varias alteraciones genéticas procesables, como EGFR, ALK, ROS1, KRAS, c-MET, RET, NTRK, BRAF y HER2, en pacientes con NSCLC y pueden tratarse con agentes para terapias dirigidas3,4,5. Sin embargo, la resistencia a los medicamentos a la terapia dirigida en este subgrupo de pacientes ocurre inevitablemente con el tiempo. Una vez agotadas las terapias dirigidas, la terapia sistémica con quimioterapia, como la quimioterapia basada en platino, con o sin incorporación de inmunoterapia utilizando inhibidores de puntos de control inmunológico (ICI), como el ligando 1 de la proteína de muerte celular programada (anti-PD-L1), anti -La proteína de muerte celular programada 1 (anti-PD-1) y los anticuerpos anticitotóxicos contra la proteína 4 asociada a linfocitos T (anti-CTLA-4) en el régimen generalmente se ofrecen como opciones de atención. Además, la resistencia a los compuestos de platino (p. ej., cisplatino y carboplatino) ocurre con frecuencia en pacientes con NSCLC6. Por lo tanto, es necesario comprender los mecanismos subyacentes para superar los obstáculos contra el uso clínico de los compuestos de platino y, finalmente, curar el cáncer.

La ligasa E3, Skp2 (proteína 2 asociada a quinasa de fase S), es un componente crucial del tipo SCF (Skp1-Cullin1-F-box) de complejos de ubiquitina-ligasa E37. Skp2 funciona como una oncoproteína y ejerce funciones oncogénicas mediante la ubiquitinación de sus sustratos como p218, p279, p5710, E-cadherin11, FOXO112, Akt13, ING314 y otros. Por lo tanto, Skp2 gobierna muchos procesos celulares críticos, incluido el crecimiento celular, la apoptosis, la diferenciación, la progresión del ciclo celular, la migración, la invasión y la metástasis15. Se ha encontrado una expresión alta de Skp2 en varios cánceres humanos15,16, incluido el NSCLC17,18, y se asocia con metástasis en los ganglios linfáticos, invasión vascular y mala supervivencia del paciente. Además, se informa que Skp2 ha desarrollado resistencia a los medicamentos en varios cánceres humanos19. Se ha demostrado que la regulación defectuosa de Skp2 está relacionada con la resistencia a la rapamicina en diferentes líneas celulares tumorales humanas20. Skp2 se asocia con resistencia a la quimioterapia preoperatoria basada en doxorrubicina21, paclitaxel19 y resistencia a gefitinib22. Un nivel alto de Skp2 confiere resistencia al cisplatino en células de carcinoma nasofaríngeo23 y células de linfoma de células del manto24. Según se informa, la regulación positiva de Skp2 mejoró la resistencia al cisplatino en las células A54925. Sin embargo, el papel de Skp2 en la resistencia al cisplatino del NSCLC no se ha dilucidado completamente.

El gen MLKL (similar al dominio de quinasa de linaje mixto) desempeña un papel crucial en la ejecución de la necroptosis26,27,28. Brevemente, la fosforilación de MLKL mediada por RIPK3 desencadena un cambio conformacional que facilita la translocación y la eventual alteración irreversible de las membranas celulares, lo que finalmente conduce a la muerte celular necroptótica29. La baja expresión de la proteína MLKL se asocia con una disminución de la supervivencia general (SG) en pacientes con adenocarcinoma de páncreas30, cáncer de colon31, cáncer de ovario32 y NSCLC33, probablemente debido a una señalización insuficiente de la necroptosis de MLKL, lo que sugiere que la necroptosis es un determinante importante de la muerte de las células cancerosas y de los resultados en estos pacientes. Sin embargo, los informes relevantes sobre la relación entre MLKL y la quimiorresistencia no están claros.

El cisplatino es uno de los fármacos quimioterapéuticos más eficaces para tratar los cánceres humanos, incluido el NSCLC34. Desafortunadamente, muchos pacientes desarrollan resistencia a los medicamentos durante el tratamiento con cisplatino. En este estudio, establecimos líneas celulares de NSCLC resistentes al cisplatino e investigamos si Skp2 tiene un papel fundamental en la resistencia al cisplatino de NSCLC. Identificamos Skp2 como una ligasa E3 que ubiquitina MLKL. La ubiquitinación y degradación de MLKL regulada por Skp2, al menos parcialmente, contribuye a la resistencia al cisplatino en las células de NSCLC. La inactivación genética o farmacológica de Skp2 vuelve a sensibilizar las células de NSCLC resistentes al cisplatino hacia el tratamiento con cisplatino, lo que sugiere que la ubiquitinación de MLKL por Skp2 es un objetivo terapéutico potencial para superar la quimiorresistencia del NSCLC.

Primero examinamos el nivel de proteína de Skp2 mediante transferencia Western en células no tumorales inmortalizadas HBE y MRC5 y un panel de líneas celulares de NSCLC humano. El resultado mostró que, excepto las células H460 y H358, Skp2 se expresó altamente en casi todas las líneas celulares de NSCLC humano analizadas (Fig. 1a, b). Además, determinamos los niveles de Skp2 en los tejidos de NSCLC y emparejamos tejidos no tumorales adyacentes. Los datos demostraron que la expresión de Skp2 aumenta significativamente en los tejidos de NSCLC en comparación con los tejidos adyacentes (Fig. 1c, d, Tabla complementaria 1). Para evaluar el efecto de Skp2 en la proliferación de células NSCLC, generamos líneas celulares H1299, H23, H125 y A549 con eliminación estable de Skp2 y validamos shRNA que mitigaron efectivamente la expresión de Skp2 después de la transfección (Fig. 1e). En comparación con el control de shGFP, la eliminación de Skp2 inhibió la proliferación celular (Fig. 1f) y el crecimiento celular independiente del anclaje (Fig. 1g) de estas líneas celulares. Para determinar el papel de Skp2 en la tumorigénesis del NSCLC in vivo, realizamos modelos de ratones desnudos atímicos. Descubrimos que la inhibición de la expresión de Skp2 suprimió significativamente el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto H23 (Fig. 1h-j). Estos resultados indican que Skp2 desempeña un papel fundamental en la tumorigénesis del NSCLC, y la eliminación de Skp2 en las células del NSCLC reduce las propiedades tumorigénicas.

Un análisis de transferencia Western examinó la expresión de Skp2 y MLKL en varias líneas celulares de NSCLC, la línea celular de fibroblastos de pulmón normal humano MRC5 y la línea celular epitelial bronquial humana inmortalizada HBE. Se utilizó β-actina como control de carga. b El diagrama de dispersión muestra una correlación negativa entre la expresión de Skp2 y MLKL en líneas celulares de NSCLC humano. Se realizaron pruebas del coeficiente de Pearson para evaluar la significación estadística. c Los niveles de proteína Skp2 y MLKL en seis casos representativos de NSCLC se evaluaron mediante análisis de transferencia Western. Se utilizó β-actina como control de carga (panel izquierdo). N, tejido no tumoral adyacente; T, tumor. La transferencia Western determinó los niveles de proteína Skp2 (panel central) y MLKL (panel derecho) en los tejidos adyacentes malignos y normales correspondientes de 22 pacientes con NSCLC. La intensidad se evaluó utilizando el software informático Image J (NIH). N = 22, **p < 0,01, ***p < 0,001 según la prueba t de Student, diferencia significativa entre grupos como se indica. d Imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica para Skp2 y MLKL en muestras representativas de 39 casos de NSCLC humano (panel izquierdo). Puntuaciones IHC para Skp2 (panel central) y MLKL (panel derecho) en 39 tumores pareados y tejidos adyacentes. N = 39, ***p < 0,001 según la prueba U de Mann-Whitney. e – g Derribo de Skp2 (e) atenuó la proliferación celular NCI-H1299, NCI-H23, NCI-H125 y A549 (n = 3) (f) y crecimiento celular independiente del anclaje en agar blando (n = 3) (g) . Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. **p < 0,01, ***p < 0,001 mediante la prueba t de Student, diferencia significativa en comparación con las células de control shGFP. h – j La eliminación de Skp2 suprime el crecimiento tumoral in vivo. Se mostraron el volumen tumoral promedio (h), los tumores de xenoinjerto fotografiados (i) y el peso tumoral promedio (j) de los xenoinjertos H23-shGFP y H23-shSkp2. Los datos se muestran como valores medios ± DE N = 5 ratones por grupo, ***p < 0,001 mediante la prueba t de Student, diferencia significativa en comparación con el grupo de control de shGFP.

Encontramos que las células NSCLC con Skp2 más alto expresaban MLKL más bajo, mientras que las células NSCLC con Skp2 más bajo tenían MLKL más alto (Fig. 1a, b). Skp2 y MLKL mostraron niveles de expresión opuestos en líneas celulares de NSCLC. Consistentemente, según lo detectado por inmunohistoquímica, en la mayoría de los casos con proteína MLKL reducida, se observó una asociación sorprendente con niveles aumentados de Skp2 y la expresión de MLKL disminuye significativamente en los tejidos de NSCLC en comparación con los tejidos adyacentes (Fig. 1c, d, Suplementario). Tabla 2). El nivel de expresión de Skp2 se correlacionó inversamente con MLKL en muestras clínicas de NSCLC (Fig. 2a-d). Para ampliar aún más nuestras observaciones a un contexto clínico-patológico relevante, realizamos un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de Skp2 y MLKL en 813 pacientes con NSCLC. Los resultados mostraron que una alta expresión de ARNm de Skp2 se asoció con una peor supervivencia general (SG). Por el contrario, la alta expresión de ARNm de MLKL se asoció significativamente con un pronóstico favorable (Fig. 2e). Estos hallazgos indican que Skp2 regula negativamente los niveles de proteína MLKL y sugieren que MLKL es un sustrato nuevo de Skp2. El eje Skp2-MLKL desempeña un papel esencial en el desarrollo del NSCLC y se correlaciona con el pronóstico de los pacientes con NSCLC.

a Se analizaron casos representativos de 39 muestras de NSCLC mediante tinción IHC con Skp2 y MLKL. b El porcentaje de muestras que muestran una expresión de Skp2 baja o alta en comparación con los niveles de expresión de MLKL. N = 39. c Las proporciones relativas de las expresiones de proteínas se ilustraron como un gráfico circular. d El diagrama de dispersión mostró una correlación negativa entre Skp2 y MLKL. e Análisis de Kaplan-Meier que muestra la correlación entre los niveles de expresión de Skp2 o MLKL y la supervivencia general (SG) de pacientes (n = 813) con NSCLC. Los datos de expresión génica y la información de supervivencia se descargaron de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO), incluidos los conjuntos de datos GSE29013, GSE37745, GSE31210 y GSE157011, basados ​​en la plataforma GPL570. Las gráficas fueron dibujadas por el software R. p <0,05 mediante la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) se consideró una diferencia estadísticamente significativa.

Para determinar si Skp2 regulaba el nivel de proteína de MLKL directamente, se cotransfectaron transitoriamente células 293T con Skp2 y MLKL. Los resultados indicaron que la coexpresión de Skp2 disminuyó MLKL de forma dependiente de la dosis (Fig. 3a). Además, el aumento ectópico de la expresión de Skp2 también causó una reducción de los niveles de MLKL endógeno (Fig. 3b) en células H358 y H460 con proteína Skp2 detectable relativamente baja pero un nivel alto de MLKL (Fig. 1a). Estos resultados indicaron que Skp2 reduce la proteína MLKL de forma exógena y endógena de manera dependiente de la dosis. La eliminación de Skp2 por shRNA aumentó la proteína MLKL endógena, acompañada de una elevación de la proteína p27, un sustrato de Skp2 bien conocido, en las células H1299, A549 y H23 (Fig. 3c). El inhibidor de Skp2 SZL P1-41, que suprime selectivamente la actividad de la ligasa E3 de Skp2 pero no la actividad de otros complejos SCF, provocó la acumulación de MLKL y p27 en las células A549 y H1299 (Fig. 3d-f). En particular, el nivel de ARNm de MLKL tras la eliminación de Skp2 fue comparable al de las células de control (Fig. 3g). Estos resultados indican que Skp2 regula la abundancia de MLKL, al menos en parte, mediante modificaciones postraduccionales.

a Expresión transitoria de la proteína Flag-MLKL reducida Skp2. Se cotransfectaron células 293T con las construcciones como se indica. Los extractos de células completas (WCE) se sometieron a análisis de transferencia Western. b La sobreexpresión de Skp2 reduce el nivel de proteína MLKL endógena. Las células H358 y H460 NSCLC se cotransfectaron con diferentes dosis de construcción de expresión Skp2, las WCE se sometieron a análisis de transferencia Western para determinar el nivel de proteína MLKL endógena. c La eliminación de Skp2 resultó en un mayor nivel de proteína MLKL endógena. Eliminación estable de Skp2 endógeno mediante shRNA en células NSCLC H1299, A549 y H23; se prepararon WCE para análisis de transferencia Western. d – f La inhibición farmacológica de Skp2 acumuló el nivel de proteína MLKL. Las células A549 y H1299 se trataron con las dosis indicadas del inhibidor de Skp2 SZL P1-41 durante 24 h, las WCE se sometieron a análisis de transferencia Western. La intensidad se evaluó utilizando el software informático Image J (NIH) (e, f). Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. ns, no estadísticamente significativo. *p < 0,05, **p < 0,01 mediante la prueba ANOVA de 1 vía con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, diferencia significativa en comparación con el grupo tratado con DMSO. g La expresión de ARNm de MLKL en células de NSCLC que silencian Skp2 se examinó mediante RT-qPCR. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. ns según la prueba t de Student, no estadísticamente significativo.

A continuación, evaluamos si Skp2 interactúa con MLKL mediante ensayos de coinmunoprecipitación. Los vectores de expresión MLKL etiquetados con GFP y Skp2 etiquetados con Flag se transfectaron solos o juntos en células 293T y la coinmunoprecipitación se realizó utilizando un anticuerpo anti-Flag o anti-GFP. Los resultados mostraron que se detectó Flag-Skp2 en los inmunoprecipitantes GFP-MLKL (Fig. 4a). GFP-MLKL también se encontró en el complejo inmune Flag-Skp2 (Fig. 4b). Luego buscamos determinar si MLKL endógeno interactúa con Skp2 en células H1299. MLKL y Skp2 se inmunoprecipitaron por separado a partir de células H1299 y la proteína recíproca se detectó mediante transferencia Western. Como se muestra en la Fig. 4c, d, tanto Skp2 como MLKL se detectaron en sus complejos inmunoprecipitados individuales pero no en los complejos de IgG de control negativo con isotipo coincidente. También se encontró interacción endógena entre MLKL y Skp2 en las células A549 (Fig. 4e, f). Además, el inhibidor de Skp2 SZL P1-41 bloqueó la asociación Skp2-MLKL en células A549 (Fig. 4g). Así, los resultados indican que MLKL y Skp2 tienen contacto físico tanto a nivel exógeno como endógeno.

a, b Análisis de co-inmunoprecipitación (Co-IP) de la interacción Skp2 y MLKL. Se transfectaron células 293T con las construcciones como se indica, las WCE se sometieron a ensayo Co-IP y análisis de transferencia Western. c, d Análisis Co-IP de la interacción endógena de Skp2 y MLKL en células H1299. Las WCE se recogieron y se sometieron a un ensayo Co-IP y análisis de transferencia Western. e, f Análisis Co-IP de la interacción endógena de Skp2 y MLKL en células A549. Las WCE se recogieron y se sometieron a un ensayo Co-IP y análisis de transferencia Western. Se trataron células g A549 con la dosis indicada del inhibidor de Skp2 SZL P1-41 durante 24 h, las WCE se sometieron a un ensayo Co-IP y análisis de transferencia Western.

Después de que la expresión ectópica de Skp2 disminuyó los niveles de proteína MLKL (Fig. 3a, b), evaluamos si Skp2 regula la estabilidad de MLKL. La proteína MLKL endógena se estabilizó mediante tratamiento con el inhibidor del proteasoma MG132 en células H1299 y H23 (Fig. 5a, Fig. 1a complementaria, carril 1 frente a carril 3). El tratamiento con MG132 enmascaró el efecto del agotamiento de Skp2 en las células H1299 y H23 (Fig. 5a, Fig. 1a complementaria, carril 2 frente a carril 4). La expresión ectópica de Skp2 disminuyó el nivel de proteína MLKL endógena, que se restableció mediante el tratamiento con el inhibidor del proteasoma MG132 en células A549 (Fig. 5b). Los resultados sugieren que MLKL es degradado por el proteosoma 26S. La vida media de MLKL se determinó mediante un experimento de persecución con cicloheximida (CHX). Los resultados demostraron que la eliminación de Skp2 extendió la vida media de la proteína MLKL (Fig. 5c, Fig. 1b complementaria), lo que sugiere que Skp2 desestabilizó la proteína MLKL. Dado que Skp2 es una ligasa E3 para que las proteínas específicas contribuyan a la degradación mediada por proteasomas a través de la ubiquitinación, determinamos si MLKL es un sustrato para la ubiquitinación inducida por Skp2. Para probar esta hipótesis, cotransfectamos células 293T con plásmidos His-Ub, GFP-MLKL y Flag-Skp2, y MLKL ubiquitinado se sometió a análisis SDS-PAGE utilizando un anticuerpo anti-GFP. Los resultados muestran que la ubiquitinación de MLKL aumentó por la sobreexpresión de Skp2 en comparación con el control del vector (Fig. 5d), mientras que la ubiquitinación de MLKL disminuyó por la inhibición de Skp2 mediada por SZL P1-41 (Fig. 5d). La eliminación de Skp2 atenuó significativamente la ubiquitinación endógena de MLKL en las células H1299 (Fig. 5e) y H23 (Fig. 1c complementaria). Estas líneas de evidencia sugieren que Skp2 regula MLKL a través de la degradación proteasomal mediada por ubiquitina.

Se analizó una expresión de MLKL en células H1299 que expresaban shGFP o shSkp2 y se trataron con MG132 (20 μM) durante 12 h. Las WCE se sometieron a análisis de transferencia Western. b Skp2 expresado ectópicamente y tratado con MG132 (20 μM) durante 12 h en células A549. Las WCE se sometieron a análisis de transferencia Western. c Las células H1299 que expresan shGFP o shSkp2 se sometieron a persecución con cicloheximida (25 μg/ml durante los tiempos indicados). Las WCE se sometieron a análisis de transferencia Western (arriba) y se calificó el nivel de proteína (abajo). Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. d Células 293T transfectadas con los plásmidos indicados y cultivadas en presencia de DMSO o compuesto SZL P1-41 (10 μM) durante 24 h, luego tratadas con MG132 (20 μM) durante 6 h seguido de un ensayo de ubiquitinación MLKL in vivo. Se trataron células H1299 con eliminación estable de Skp2 con MG132 (20 μM) durante 6 h, se prepararon WCE y se sometieron a análisis de ubiquitinación MLKL utilizando un anticuerpo de ubiquitina.

Dada la regulación de la estabilidad de MLKL por Skp2, preguntamos si la expresión de Skp2 y MLKL está alterada en células resistentes al cisplatino. Se indujeron células H1299 y A549 mediante exposición continua y concentraciones crecientes graduales de cisplatino durante más de 6 meses para establecer células resistentes. El ensayo de viabilidad celular mostró que 20 μM de cisplatino condujeron a una inhibición del crecimiento celular de más del 50% en células H1299 y A549. Sin embargo, las células H1299R y A549R resistentes al cisplatino resistieron las propiedades inhibidoras del crecimiento del cisplatino 20 μM (Fig. 6a). Obviamente, Skp2 estaba regulado positivamente en las células resistentes en comparación con las líneas celulares parentales. Por el contrario, MLKL, RIP1 y RIP3 estaban regulados negativamente (Fig. 6b). Para determinar si se requiere un alto nivel de Skp2 para mantener la resistencia al cisplatino, se transfectaron ARNip de Skp2 en células H1299R y A549R resistentes al cisplatino para eliminar la expresión de Skp2. Los resultados indicaron que el agotamiento de Skp2 mediado por ARNip estuvo acompañado por un aumento de la proteína MLKL en las células H1299R y A549R (Fig. 6c). El cisplatino atenuó sustancialmente la viabilidad celular en las células parentales H1299 y A549, independientemente del estado de Skp2. Sin embargo, el efecto inhibidor significativo solo se observó en la eliminación de Skp2, pero no en las células siCtrl-H1299R (Fig. 6d) y siCtrl-A549R (Fig. 6e). Tras la exposición aguda al cisplatino, la disminución del nivel de proteína Skp2 estuvo acompañada por un ligero aumento del nivel de proteína MLKL en las células A549 parentales, mientras que los niveles de proteína Skp2 y MLKL no cambiaron obviamente en las células A549R (Figura complementaria 2). También evaluamos la interacción endógena de MLKL y Skp2 en presencia/ausencia de cisplatino a través de Co-IP en células A549R y A549. La asociación endógena entre MLKL y Skp2 disminuyó tanto en las células A549R como en las A549 tratadas con cisplatino (Fig. 6f, g). Además, la expresión ectópica de MLKL mejoró la viabilidad celular reducida por cisplatino en células H1299R y A549R (Fig. 6h, i). Para determinar si la quimiorresistencia se asoció con la regulación negativa de MLKL mediada por Skp2 en células de NSCLC, examinamos la eficacia del inhibidor de Skp2, SZL P1-41, para anular la resistencia al cisplatino. Aunque el cisplatino y SZL P1-41 solos disminuyeron parcialmente la viabilidad celular en las células H1299R y A549R, la terapia combinada mejoró los efectos antitumorales (Fig. 6j, k). Los resultados indicaron que la recuperación genética o farmacológica de MLKL atenúa la resistencia al cisplatino en las células de NSCLC. En conjunto, estos resultados sugieren que la sobreexpresión de Skp2 media la ubiquitinación y degradación de MLKL involucradas en la resistencia al cisplatino en el NSCLC.

a Comparación de la tasa de inhibición de la proliferación de células H1299/H1299R y A549/A549R en las concentraciones indicadas de cisplatino durante 72 h. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. p < 0,001 según la prueba t de Student. b El análisis de transferencia Western mostró el nivel de proteína de Skp2, MLKL, RIP1 y RIP3 en células establecidas resistentes al cisplatino (H1299R y A549R) y células parentales (H1299 y A549). c – e El silenciamiento de Skp2 mejora la sensibilidad de las células de NSCLC resistentes al cisplatino al cisplatino. El control o ARNip de Skp2 se transfectó transitoriamente en células H1299R y A549R durante 72 h. La eliminación de Skp2 se confirmó mediante análisis de transferencia Western (c). Las células parentales (H1299 y A549) y resistentes al cisplatino (H1299R y A549R) se transfectaron transitoriamente durante 24 h con el control o ARNip de Skp2, se tripsinizaron y se transfirieron a una placa de 96 pocillos sin o con cisplatino (20 μM) durante 48 h, seguido del ensayo de viabilidad celular (d, e). Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. ***, p < 0,001 mediante la prueba ANOVA de 1 factor con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, diferencia significativa entre los grupos como se indica. f, g Las células A549R (f) y A549 parentales (g) resistentes al cisplatino se trataron sin/con cisplatino (20 μM) durante 48 h, se recolectaron WCE y se sometieron a un ensayo Co-IP y análisis de transferencia Western. h, i Expresé ectópicamente MLKL después del tratamiento con cisplatino y realicé ensayos de viabilidad celular en células H1299R y A549R. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. ***p < 0,001 mediante la prueba t de Student, diferencia significativa en comparación con el grupo infectado con Vector tratado con cisplatino. Células j, k H1299R y A549R tratadas con el control del vehículo, cisplatino (20 μM), el inhibidor de Skp2 SZL P1-41 (10 μM) o una combinación de cisplatino y SZL P1-41 durante 48 h, seguido de ensayos de viabilidad celular. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. **p < 0,01, ***p < 0,001 mediante la prueba ANOVA de 1 vía con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, diferencia significativa en comparación con el grupo tratado con cisplatino o el grupo tratado con SZL P1-41.

Dado que la regulación positiva de Skp2 estuvo acompañada por la regulación negativa de los reguladores MLKL, RIP1 y RIP3 relacionados con la necroptosis en células H1299R y A549R resistentes al cisplatino (Fig. 6b), investigamos más a fondo el estado de ubiquitinación de MLKL en células resistentes al cisplatino. Los resultados demostraron que, en comparación con las células A549 parentales, se produjo un aumento significativo de la ubiquitinación de MLKL en las células A549R resistentes al cisplatino (Fig. 7a). En particular, el tratamiento previo con el inhibidor de la necroptosis Necrostatina-1 (Nec-1) comprometió significativamente la viabilidad celular reducida por cisplatino en las células A549R tratadas con Skp2-knockdown (Fig. 7b) y SZL P1-41 (Fig. 7c), lo que sugiere que la necroptosis podría estar involucrado en la resistencia de las células NSCLC al cisplatino. El resultado de WB mostró que Nec-1 eliminó significativamente la fosforilación de RIPK1 en Ser166 en células A549, lo que indica que Nec-1 está funcionando adecuadamente (Figura complementaria 3). Además, la eliminación transitoria de MLKL por ARNip comprometió la viabilidad celular reducida por cisplatino en células estables H1299R-shSkp2 y A549R-shSkp2, lo que confirma el papel crítico de MLKL en la resistencia al cisplatino en NSCLC (Fig. 7d, e). Los tumores de xenoinjerto derivados de células A549R con eliminación de Skp2 tratadas con cisplatino mostraron una disminución significativa en el crecimiento y el peso en comparación con los tumores derivados de células shGFP-A549R tratadas con cisplatino (Fig. 7f-h). Los datos de IHC revelaron que los tumores de xenoinjerto de células A549R con desactivación de Skp2 tratadas con cisplatino mostraron una disminución significativa en el nivel de proteína de Skp2, Ki67 y una elevación de la proteína MLKL y la fosforilación en Thr357, que es crítica para la necroptosis36, en comparación con los tumores tratados con cisplatino. Tumores de xenoinjerto shGFP-A549R (Fig. 7i, j). En conjunto, estos resultados sugieren que la degradación de MLKL ubiquitinado por Skp2 juega un papel crítico en la resistencia al cisplatino y que la combinación de cisplatino con inhibidores de Skp2 podría ser una estrategia prometedora para superar la quimiorresistencia en las células de NSCLC.

a Las células A549 parentales y las células A549R resistentes al cisplatino se trataron con MG132 durante 6 h, se prepararon WCE y se sometieron a análisis de ubiquitinación MLKL. b Las células estables A549R resistentes al cisplatino se trataron previamente con necrostatina-1 50 μM durante 1 h y luego se trataron con DMSO o cisplatino (20 μM) durante 48 h. Se midió la viabilidad celular. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. ***p < 0,001 según la prueba t de Student. c Las células A549R resistentes al cisplatino se trataron previamente con necrostatina-1 50 μM durante 1 h y luego se trataron con DMSO, cisplatino (20 μM), SZL P1-41 (10 μM) o una combinación de cisplatino y SZL P1-41 durante 48 h. Se midió la viabilidad celular. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. ***, p < 0,001 mediante la prueba t de Student. d, e Las células estables H1299R-shSkp2 y A549R-shSkp2 fueron eliminadas transitoriamente por MLKL mediante ARNip después sin o con tratamiento con cisplatino y se realizaron ensayos de viabilidad celular. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. **p < 0,01, ***p < 0,001 según la prueba t de Student, diferencia significativa en comparación con las células desactivadas Skp2 tratadas con cisplatino. f – h Tumorigénesis de células estables A549R resistentes al cisplatino tratadas con vehículo o cisplatino. Se registró el volumen del tumor (f), se controló el tamaño del tumor (g) y se pesaron los tumores (h). Barra de escala, 1 cm. N = 5 ratones por grupo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 Prueba ANOVA de 1 vía con prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. i, j Tinción IHC de Skp2, MLKL, Ki67 y fosfo-MLKL Thr357 en tumores de xenoinjerto del vehículo o células estables shGFP-A549R y shSkp2-A549R tratadas con cisplatino. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. Barra de escala, 25 μm. ***p < 0,001 Prueba ANOVA de 1 vía con prueba de comparaciones múltiples de Dunnett.

Está bien establecido que Skp2 requiere la fosforilación previa de sus objetivos para su destrucción. La mayoría de los objetivos de Skp2 se reconocen cuando se fosforilan7. Por ejemplo, la fosforilación de p27 en Thr187 por CDKs37, la fosforilación de FOXO1 en Ser256 por Akt12 o la fosforilación de RASSF1A en Ser203 por ciclinaD-CDK438 son necesarias para la ubiquitinación y degradación mediada por Skp2. Skp2 interactúa y promueve la ubiquitinación y destrucción de la E-cadherina fosforilada de caseína quinasa I (CKI). La mutación de los sitios fosforilados por CKI elimina la ubiquitinación y degradación de E-cadherina mediada por Skp2 y reduce significativamente la capacidad de migración celular11. La fosforilación de PDCD4 en Ser67 por Akt es un requisito para la ubiquitinación de PDCD4 regulada por Skp239. Se han identificado múltiples sitios de fosforilación en MLKL, incluida la fosforilación mediada por RIPK3 en Ser345, Ser347 y Thr349 en ratones, y Thr357 y Ser358 en humanos26,36,40. Otro sitio en MLKL humano, correspondiente a MLKL Ser124 de ratón, fue fosforilado por una quinasa desconocida de una manera dependiente del ciclo celular durante la transición de fase G1 a M41,42. Además, Ser228 y Ser248 en MLKL de ratón están sujetos a fosforilación mediada por RIPK343. Recientemente, se ha identificado que los miembros de la familia TAM (Tyro3, ​​Axl y Mer) de tirosina quinasas receptoras fosforilan Tyr376 de MLKL bajo estrés necroptótico, lo que promueve la oligomerización de MLKL44. Nuestro resultado mostró que Skp2 promovió la ubiquitinación de MLKL (Fig. 5d) y el inhibidor de Skp2 SZL P1-41 bloqueó la ubiquitinación de MLKL (Fig. 5d), lo que sugiere que Skp2 participó en la regulación de la poliubiquitinación de MLKL. Sin embargo, es necesario investigar más a fondo si MLKL necesita una fosforilación previa por parte de la quinasa aguas arriba y los mecanismos subyacentes al reconocimiento de MLKL por Skp2. Además, la expresión alta de ARNm de Skp2 o baja de ARNm de MLKL en tejidos tumorales de NSCLC se asoció con una peor supervivencia general (SG) mediante un análisis de herramientas en línea (Fig. 2e). Aunque la integración de varios conjuntos de datos aumentó el tamaño de la muestra, el valor pronóstico proveniente de diferentes cohortes de pacientes con supervivencia/expresión genética muy diferente puede causar sesgo en los resultados. Además, se requiere más evidencia para aclarar el mecanismo de regulación entre ellos y sus valores clínicos en los niveles de proteína porque nuestros resultados indicaron que Skp2 regulaba la proteína MLKL de manera dependiente de la ubiquitinación.

Skp2 puede conjugar dos cadenas de poliubiquitinación unidas a K48 y K63 convencionales con diferentes objetivos. La ubiquitinación ligada a K48 por Skp2 regula la estabilidad de las proteínas y conduce a la proteólisis de proteínas específicas mediada por proteasoma. Por ejemplo, Skp2 induce la poliubiquitinación ligada a K48 de p2745, FOXO112, mH2A146 y PDCD439 seguida de una degradación mediada por proteasoma. Además, el Skp2 no proteolítico media la poliubiquitinación de sustratos ligada a K63 para ejercer otras funciones de regulación, incluido el tráfico, la localización subcelular y la activación de quinasas. Akt es un sustrato de Skp2 que sufre poliubiquitinación ligada a K63, lo que conduce a la activación de Akt y al reclutamiento de membrana13. La tenascina-C está ubiquitinada en K63 por Skp2, particularmente en K942 y K1882, promoviendo así su reconocimiento por p62 y su degradación autofágica selectiva47. Skp2 interactúa directamente con Aurora B y desencadena la ubiquitinación ligada a Aurora B K63 para regular la activación de Aurora B en la mitosis celular y el punto de control del huso48. Skp2 interactúa con NBS1 y desencadena la ubiquitinación de NBS1 ligada a K63 durante las roturas de doble hebra del ADN (DSB), promoviendo la interacción de NBS1 con ATM, que es fundamental para la activación de ATM en respuesta al daño del ADN49. Además de los sustratos mencionados anteriormente, Skp2 también induce la ubiquitinación ligada a K63 de muchos otros sustratos, como Akt13, Twist50, LKB151, YAP52, RagA53, Bcr-Abl39 y MTH154. Nuestro resultado mostró que Skp2 promovió la ubiquitinación de MLKL (Fig. 5d, e, Fig. 1c complementaria) y la proteína MLKL endógena se estabilizó mediante el tratamiento con inhibidor del proteasoma MG132 (Fig. 5a, Fig. 1a complementaria, carril 1 frente a carril 3). La expresión ectópica de Skp2 disminuyó el nivel de proteína MLKL endógena, que se restableció mediante el tratamiento con el inhibidor del proteasoma MG132 (Fig. 5b). Estos resultados sugirieron que el MLKL ubiquitinado sufre una degradación dependiente del proteasoma. La ubiquitinación ligada a K48 es el tipo de cadena Ub más abundante que se dirige a proteínas para la degradación proteasomal. Sin embargo, un informe anterior mostró que toda ubiquitinación no ligada a K63 podría resultar en la degradación proteasomal de proteínas55. Informes recientes muestran que la ubiquitinación ligada a K656 y K1157 podría dar como resultado una degradación proteasomal de proteínas.

La eliminación de Skp2 es más eficaz para aumentar la citotoxicidad del cisplatino en células resistentes al cisplatino, lo que sugiere que es probable que Skp2 sea un objetivo más prometedor en el tratamiento de células tumorales resistentes al cisplatino24. De manera similar, la deficiencia de Skp2 aumentó la sensibilidad de las células CRPC al tratamiento con doxorrubicina o paclitaxel. Además, la doxorrubicina o el paclitaxel, junto con el compuesto inhibidor de Skp2 nº 25 (SZL P1-41), aumentaron sustancialmente la citotoxicidad de las células CRPC50. Estudios recientes indican que la deficiencia de Skp2 hace que las células de cáncer de mama Her2 positivas sean más sensibles al tratamiento con Herceptin y prolonga la supervivencia de los pacientes Her2 positivos, lo que destaca que Skp2 es un objetivo terapéutico atractivo para combinar con Herceptin para el tratamiento del cáncer13. Además, la ablación genética o la inactivación farmacológica de Skp2 vuelve a sensibilizar las células de NSCLC resistentes a gefitinib hacia el tratamiento con gefitinib, mejorando el potencial de Skp2 para superar la resistencia a gefitinib en pacientes con NSCLS22. De acuerdo con estos informes, nuestros resultados demostraron que un efecto inhibidor significativo del cisplatino solo se observó en la eliminación de Skp2, pero no en las células H1299R (Fig. 6d) y A549R (Fig. 6e, 7b, 7f – h). Nuestros resultados indicaron que la eliminación de Skp2 induce la expresión de p27 (Fig. 3c). La fase M y la fase G2 son las etapas más sensibles a la radioterapia o a los agentes que dañan el ADN. La eliminación de Skp2 induce la expresión de p27 y la detención del ciclo celular, lo que puede mejorar el efecto antitumoral del cisplatino por daño al ADN. Se han realizado esfuerzos para desarrollar nuevos inhibidores basados ​​en diferentes estrategias, y la combinación de estos agentes con quimioterapia convencional parece ser un enfoque atractivo para tratar los cánceres resistentes a la quimioterapia.

La propiedad oncogénica de Skp2 lo convirtió en un objetivo farmacológico atractivo para la prevención y el tratamiento del cáncer. En los últimos años se han desarrollado varios inhibidores específicos de Skp2. Se identifica que SZL-P1 41 se une físicamente a Skp2, previniendo así la formación del complejo Skp2 SCF e inhibiendo la actividad de la ligasa E3 de Skp2, suprimiendo la supervivencia de las células cancerosas tanto in vitro como in vivo 35. El compuesto A (CdpA) inhibe la ubiquitinación de p27 mediada por Skp2 y la actividad de la ligasa E3 de Skp2 al excluir Skp2 del complejo SCF, induciendo así la detención del ciclo celular G1/S y la destrucción de células tumorales58. Los compuestos NSC689857 y NSC681152 interrumpen la interacción entre Skp2 y Cks1, lo que inhibe que Skp2 reconozca la p27 fosforilada de Thr187 y la ubiquitinación posterior59. Se ha descubierto que el compuesto SMIP0004 restringe la expresión de Skp2, protegiendo así a p27 de la degradación para inducir la acumulación de p27, inhibiendo finalmente el crecimiento de células de cáncer de próstata e induciendo la apoptosis60. Aunque es necesario justificar aún más la eficacia de estos compuestos para el cáncer humano, Skp2 sigue siendo un objetivo atractivo para la terapia contra el cáncer. El desarrollo de un inhibidor específico de Skp2 con pocos efectos secundarios beneficiaría la terapia contra el cáncer.

El deterioro de las vías de muerte celular o la resistencia a la muerte celular es una característica distintiva de varios cánceres, que es la principal razón de la resistencia a la quimioterapia, un problema importante en el tratamiento actual del cáncer61. Al igual que la apoptosis, las células tumorales pueden desarrollar resistencia contra la necroptosis para garantizar la supervivencia62. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento previo con el inhibidor de la necroptosis Necrostatina-1 comprometió significativamente la viabilidad celular reducida por cisplatino en las células A549R tratadas con Skp2-knockdown (Fig. 7b) y SZL P1-41 (Fig. 7c), lo que sugiere que el mecanismo de necroptosis podría estar involucrado en la resistencia de las células NSCLC al cisplatino. Por lo tanto, aún es necesario explorar nuevas terapias que induzcan muertes celulares programadas, incluidas la apoptosis y la necroptosis. Como efector de la necroptosis, MLKL está regulado transcripcionalmente por IFN en las células cancerosas, lo que lleva a un nivel más alto de MLKL que sensibiliza a las células hacia la necroptosis63. La inhibición genética o farmacológica de MLKL rescata significativamente las células PC de la muerte celular inducida por BV6, BV6/TNFα o 2'3'-cGAMP/BV6/zVAD.fmk64,65. La regulación positiva de MLKL mediante la sobreexpresión de ID1 sensibiliza a las células de NSCLC al tratamiento con gefitinib mediante la inducción de la muerte celular necroptótica66. La inhibición de la actividad de MLKL por necrosulfonamida (NSA) atenuó significativamente la muerte celular inducida por cisplatino en células HepG2/DDP resistentes al cisplatino que sobreexpresan RIP3, lo que indica que MLKL contribuyó a la muerte de células HepG2/DDP-RIP3 desencadenada por cisplatino67. Estos estudios sugieren que alterar el nivel o la actividad de la proteína MLKL podría ser valioso para sensibilizar a las células hacia la muerte celular necroptótica y superar la resistencia a la apoptosis de las células cancerosas. Nuestros resultados indicaron que Skp2 aumentó en las células H1299R y A549R resistentes al cisplatino, acompañado de una disminución de MLKL (Fig. 6b). De manera similar, Skp2 aumenta en las células de cáncer de próstata resistentes a paclitaxel68 y en las células de mieloma múltiple resistentes a bortezomib, carfilzomib o ixazomib, inhibidores del proteosoma69. También proporcionamos evidencia de que Skp2 regula MLKL a través de la degradación proteasómica mediada por ubiquitina (Fig. 5, Fig. 1 complementaria), lo que sugiere que, al menos en parte, la regulación positiva de Skp2 es responsable de la regulación negativa de MLKL en células de NSCLC con resistencia adquirida al cisplatino. . Nuestros resultados mostraron que la regulación positiva de Skp2 también estuvo acompañada por la disminución de RIP1 y RIP3 en las células H1299R y A549R resistentes al cisplatino (Fig. 6b). Investigaciones recientes informaron que el silenciamiento epigenético somático de RIP3 inactiva la necroptosis y contribuye a la quimiorresistencia en el mesotelioma maligno70. Por lo tanto, no podríamos excluir la posibilidad de que RIP1 y/o RIP3 estén regulados por Skp2 y sean responsables de la resistencia al cisplatino en las células de NSCLC, y es necesario explorar más a fondo los mecanismos subyacentes a cómo Skp2 regula RIP1 y RIP3.

Estudios recientes indican que MLKL sufre múltiples formas de modificaciones degradativas y no degradativas de la ubiquitina con diferentes efectos sobre la necroptosis71,72,73,74. MLKL está ubiquitinado con K63 en K51, K77, K172 y K219, lo que requiere fosforilación inducida por RIPK3 durante la necroptosis y ubiquitilación simultáneamente. La ubiquitinación de K219 protege a los ratones del daño cutáneo inducido por la necroptosis y hace que las células sean resistentes a la muerte celular mediada por MLKL73. Se ha informado que el MLKL K230 humano, que corresponde al residuo K219 de MLKL murino, es un sitio de ubiquitinación75. Además, según se informa, los inhibidores del proteasoma facilitan la estabilización de MLKL, lo que respalda el papel potencial de la degradación de MLKL72 mediada por proteasoma. Curiosamente, la multimonoubiquitilación específica de necroptosis de MLKL se produce después de su activación y oligomerización71. Nuestros resultados mostraron que Skp2 regulaba la estabilidad de MLKL y promovía la ubiquitinación y degradación de MLKL a través del proteosoma (Fig. 5, Fig. 1 complementaria), lo que sugiere que Skp2 participa en la modificación de MLKL con ubiquitinación K48. Aunque los mecanismos moleculares y las consecuencias celulares de la ubiquitinación de MLKL están comenzando a surgir, es necesario aclarar muchas cuestiones fundamentales, como las ligasas E3 responsables de la mono o poliubiquitinación de MLKL.

El presente estudio vincula Skp2 con un componente clave del complejo de necroptosis MLKL con la resistencia al cisplatino en el NSCLC. El estudio proporciona una prueba de concepto para apuntar a Skp2 como estrategia para superar la resistencia terapéutica y proporciona la justificación para desarrollar nuevas combinaciones de fármacos para mejorar la eficacia de las terapias basadas en cisplatino en el NSCLC. En resumen, demostramos que el eje Skp2-MLKL podría contribuir a la resistencia al cisplatino mediante la inhibición de la muerte de las células cancerosas en el NSCLC. Nuestro estudio ofrece evidencia convincente de que la inactivación farmacológica de Skp2 con agentes quimioterapéuticos actuales es un enfoque prometedor para el tratamiento de pacientes con NSCLC con tratamientos previos fallidos.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Segundo Hospital Xiangya o el Comité de Ética del Hospital Xiangya, Universidad Central Sur, China. Todos los pacientes proporcionaron su consentimiento informado por escrito. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal en Investigación Médica de la Universidad Central del Sur, China. Se obtuvo la aprobación ética y el consentimiento informado para cumplir con los requisitos institucionales.

El cisplatino y los reactivos químicos, incluidos Tris, NaCl, SDS y DMSO, para biología molecular y preparación de tampón se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Los medios de cultivo celular y los suplementos eran de Invitrogen (Grand Island, NY). El inhibidor de Skp2 SZL P1-41 (#HY-100237) se adquirió de MedChem Express (Monmouth Junction, Nueva Jersey). Necrostatina-1 (n.º S8037), cicloheximida (CHX, n.º S7418) y MG132 (n.º S2619) se adquirieron en Selleck (Houston, TX). El ARNip de control (n.° 6568), el ARNip I de Skp2 (n.° 7753) y el ARNip II de Skp2 (n.° 7756) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). El ARNip de MLKL (sc-93430) se adquirió de Santa Cruz (Dallas, TX). Anticuerpos contra Skp2 (#2652, 1:1000), MLKL (#14993, 1:1000), RIP1 (#3493, 1:1000), fosfo-RIPK1 Ser166 (#44590, 1:1000), RIP3 (#13526, 1:1000), ubiquitina (#3936, 1:1000) y p27 (#3686, 1:1000) se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos contra β-actina (A5316, 1:10000), Flag tag (F3165, 1:1000) y Flag-HRP (A8592, 1:10000) eran de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El anticuerpo contra la etiqueta GFP (TA150032, 1:1000) se adquirió de OriGene (Rockville, MD). El anticuerpo MLKL (#GTX107538, 1:1000) era de GeneTex (Irvine, CA). El anticuerpo MLKL (#orb32399, 1:1000) era de Biorbyt (St. Louis, MO). RIP3 (NBP1-77299, 1:1000) era de Novus Biologicals (Littleton, CO). Phospho-MLKL Thr357 (#MAB9187, 1:1000) era de R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN). Los anticuerpos secundarios, que incluyen IgG HRP anti-conejo (n.° 7074, 1:10000) y HRP IgG anti-ratón (n.° 7076, 1:10000) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los conjugados de anticuerpos se visualizaron mediante quimioluminiscencia (ECL; cat. n.º 34076, Thermo Fisher, Waltham, MA).

Los tejidos tumorales de NSCLC y los correspondientes tejidos no tumorales adyacentes para el análisis de transferencia Western se obtuvieron del Departamento de Cirugía Torácica del Segundo Hospital Xiangya con consentimiento informado por escrito (n = 22). Los tejidos tumorales de NSCLC y los correspondientes tejidos adyacentes no tumorales para el análisis de tinción inmunohistoquímica (IHC) se obtuvieron del Departamento de Patología del Hospital Xiangya y del Segundo Hospital Xiangya (n = 39). Todas las muestras se recolectaron con consentimiento informado por escrito siguiendo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (2022826) por el Comité de Ética Médica del Segundo Hospital Xiangya de la Universidad Central Sur. Los pacientes fueron diagnosticados y clasificados por el Departamento de Patología del Hospital Xiangya y el Segundo Hospital Xiangya siguiendo las directrices de la OMS. Ninguno de los pacientes recibió tratamiento antes de la cirugía.

Células de NSCLC humano, incluidas NCI-H23 (CRL-5800TM), NCI-H125 (CRL-5801TM), NCI-H460 (HTB-177TM), NCI-H520 (HTB-182TM), NCI-H1299 (CRL-5803TM), NCI-H358 (CRL-5807TM), NCI-H1650 (CRL-5883TM), HCC827 (CRL-2868TM) de la American Type Culture Collection (ATCC) se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de antibióticos según los protocolos de la ATCC. Se cultivaron células humanas de NSCLC A549, células epiteliales bronquiales inmortalizadas (HBE), fibroblastos de pulmón humanos inmortalizados MRC5 y células 293T como se describió anteriormente76,77. Las células se probaron y autenticaron citogenéticamente antes de congelarlas. Cada vial de células congeladas se descongeló y se mantuvo durante 2 meses (10 pases). Para establecer líneas celulares resistentes al cisplatino, se indujeron células H1299 y A549 mediante exposición continua y concentraciones crecientes graduales de cisplatino (inicialmente con 1 μM hasta un máximo de 20 μM). Las células resistentes se mantuvieron continuamente en un medio que contenía cisplatino 20 µM durante más de 6 meses y se utilizaron para experimentos posteriores.

Los plásmidos de lentivirus que contienen pLKO.1-shSkp2 se adquirieron de Thermo Scientific. El pLKO.1-shGFP (plásmido n.° 30323), el plásmido de empaquetamiento lentiviral psPAX2 (plásmido n.° 12260) y el plásmido de envoltura pMD2.G (plásmido n.° 12259) estaban disponibles en Addgene (Cambridge, MA). Las construcciones de expresión pCMV6-Entry-Skp2 (#RC214001) y pCMV6-Entry-MLKL (#RC213152) se adquirieron de OriGene (Rockville, MD). La construcción de expresión de MLKL pEGFP-MLKL se adquirió de Youbio (Changsha, CN). La generación de genes estables que derriban las líneas celulares NCI-H1299, NCI-H23, NCI-H125 o A549 se realizó como se describió anteriormente77. Para la expresión transitoria de MLKL o Skp2 mediante transfección de plásmido, las células en placas de 6 pocillos se transfectaron transitoriamente con 2,0 μg de construcción con Lipofectamine 2000 (#11668-019, Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 48 h siguiendo las instrucciones del fabricante. La interferencia de ARN se realizó como se describió anteriormente77. Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos y se transfectaron con 100 pmol de ARNip de control (n.° 6568), ARNip I de Skp2 (n.° 7753), ARNip II de Skp2 (n.° 7756) o siMLKL (sc-93430) utilizando el reactivo de transfección HiPerFect (n.° 301705, Qiagen) durante 72 h según las instrucciones del fabricante y la eliminación de Skp2 se confirmó mediante análisis de transferencia Western.

Las muestras de tejido congeladas se seccionaron en trozos pequeños y se disolvieron en tampón de lisis que contenía Tris-Cl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, SDS al 0,1 %, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 100 μg/ml, aprotinina 2 μg/ml, leupeptina 2 μg/ml. y 1% NP-40. Las muestras fueron homogeneizadas, sonicadas y mantenidas en hielo durante 30 min. Después de la centrifugación, se recogió el sobrenadante para análisis de inmunotransferencia. Se recogieron células cultivadas y se prepararon lisados ​​de células completas. La concentración de proteína se determinó utilizando el reactivo de ensayo BCA (n.º de catálogo 23228, Pierce, Rockford, IL).

La RT-qPCR se realizó como se describió anteriormente78. Los cebadores para MLKL son los siguientes: Secuencia directa: ttcacccataagccaaggag; Secuencia inversa: cccagaggacgattccaaag. Los cebadores para GAPDH son los siguientes: Secuencia directa: tgttgccatcaatgacccctt; Secuencia inversa: ctccacgacgtactcagcg.

Se sembraron células (2 x 103 por pocillo) en placas de 96 pocillos y se trataron con diferentes dosis de compuestos o control DMSO. La viabilidad celular se examinó en varios momentos utilizando el reactivo WST-1 (Roche, Mannheim, Alemania) como se describió anteriormente77.

Se sembraron células (8 x 103 por pocillo) en placas de 6 pocillos con agar Eagle medio basal al 0,3% que contenía FBS al 10% y se cultivaron. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5% durante 2 o 3 semanas. Las colonias se contaron bajo un microscopio como se describió anteriormente77.

Los ensayos de Co-IP se realizaron como se describió anteriormente76. Se utilizaron anticuerpos para la inmunoprecipitación: MLKL (#GTX107538A, GeneTex), Skp2 (#2652, Cell Signaling Technology) o IgG de conejo normal (NI01, Calbiochem). Los inmunocomplejos se resolvieron mediante SDS-PAGE y las proteínas coinmunoprecipitadas se detectaron utilizando Skp2 (n.° 2652, Cell Signaling Technology) y MLKL (n.° 66675-1-Ig, Proteintech), respectivamente. Se utilizó el reactivo de detección de IP (HRP) VeriBlot (#ab131366, Abcam) para evitar la interferencia de las cadenas ligeras y pesadas de IgG desnaturalizadas.

Los tejidos de NSCLC y los tejidos adyacentes emparejados se fijaron, incluyeron y sometieron a análisis IHC79 y dos patólogos evaluaron de forma independiente las inmunorreacciones como se describió anteriormente23.

Para la detección de ubiquitinación endógena, las células se recolectaron y lisaron con tampón RIPA modificado (NAP 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Tritón al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 % y SDS al 1 %) suplementado con inhibidores de proteasa y N2 10 mM. -Etilmaleimida (NEM). Después de la sonicación, los lisados ​​se hirvieron a 95 °C durante 15 minutos, se diluyeron con tampón RIPA que contenía SDS al 0,1% y luego se centrifugaron a 4 °C (16000 x g durante 15 minutos). El sobrenadante se incubó con anticuerpo específico y perlas de proteína A-Sefarosa durante la noche a 4 °C. Después de un lavado exhaustivo, las proteínas unidas se eluyeron con 2 x tampón de carga de muestra SDS y se separaron en un SDS-PAGE, seguido de transferencia Western. Para el ensayo de extracción de níquel, las células se sedimentaron y se lisaron con tampón de lisis (guanidina-HCl 6 M, Na2HPO4/NaH2PO4 0,1 M, Tris/HCl 0,01 M, pH 8,0, imidazol 5 mM y β-mercaptoetanol 10 mM) suplementados. con inhibidores de proteasa y N-etilmaleimida (NEM) 10 mM. Después de la sonicación y centrifugación, el sobrenadante se incubó con 50 ml de Ni-NTA-agarosa (QIAGEN Inc, Valencia, CA) a temperatura ambiente durante 4 h. Las perlas se lavaron con los siguientes tampones: (1) guanidina-HCl 6 M, Na2HPO4/NaH2PO4 0,1 M, Tris/HCl 0,01 M, pH 8,0, imidazol 5 mM más β-mercaptoetanol 10 mM; (2) Urea 8 M, Na2HPO4/NaH2PO4 0,1 M, Tris/HCl 0,01 M, pH 8,0, imidazol 10 mM, β-mercaptoetanol 10 mM más Triton X-100 al 0,1%; (3) urea 8 M, Na2HPO4/NaH2PO4 0,1 M, Tris/HCl 0,01 M, pH 6,3, β-mercaptoetanol 10 mM (tampón A), imidazol 20 mM más Triton X-100 al 0,2 %, (4) tampón A con 10 imidazol mM más Triton X-100 al 0,1%; (5) tampón A con imidazol 10 mM más Triton X-100 al 0,05%. Después del último lavado, las proteínas se eluyeron con un tampón de carga de muestra 2x SDS que contenía imidazol 200 mM y se separaron en un SDS-PAGE, seguido de transferencia Western.

Todos los ratones se mantuvieron y manipularon de acuerdo con estrictas pautas establecidas por el Comité de Ética Animal en Investigación Médica (20220585), Universidad Central del Sur, China. Se inyectaron sc células (1 x 106) en ratones desnudos atímicos de 6 semanas de edad (n = 5) en el flanco derecho para generar el modelo de ratón con xenoinjerto. Los tumores se midieron con un calibrador cada 3 días. El volumen del tumor se registró y se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: volumen del tumor (mm3) = (largo x ancho x ancho/2). Los ratones fueron monitoreados hasta el punto final. En ese momento, los ratones fueron sacrificados y se les extrajeron los tumores.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete estadístico SPSS (versión 16.0 para Windows, SPSS Inc, Chicago, IL, EE. UU.) y GraphPad Prism (GraphPad 7.0, San Diego, CA, EE. UU.). Todos los datos cuantitativos se expresan como valores medios ± DE de tres experimentos independientes. Las diferencias entre medias se evaluaron mediante la prueba t de Student o análisis de varianza (ANOVA) cuando los datos se distribuyeron normalmente. La prueba de χ² se utilizó para evaluar las asociaciones entre varios parámetros clínico-patológicos Skp2 y MLKL. Para las pruebas de correlación se utilizó la correlación de rangos de Pearson. Se utilizó un valor de probabilidad de p < 0,05 como criterio de significación estadística.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Las imágenes de transferencia/gel sin recortar ni editar están disponibles en la Fig. 4 complementaria. Los datos de origen están disponibles en los Datos complementarios 1.

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Los autores agradecen a John Angles (Universidad de Albany, Universidad Estatal de Nueva York) por su asistencia editorial. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 82073260, 81972837, 82003203, 81572280, 81401548) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Hunan (Subvención No. 2021JJ31011, 2021JJ41058, 2019JJ40420).

Estos autores contribuyeron igualmente: Huiling Zhou, Li Zhou.

Departamento de Cirugía Cardiovascular, Segundo Hospital Xiangya de la Universidad Central Sur, Changsha, Hunan, China

Huiling Zhou, Qing Guan, Xuyang Hou, Lijun Liu, Jian Wang y Haidan Liu

Centro clínico de diagnóstico y terapia genética, Segundo Hospital Xiangya de la Universidad Central Sur, Changsha, Hunan, China

Huiling Zhou, Qing Guan, Xuyang Hou, Cong Wang, Lijun Liu, Jian Wang y Haidan Liu

Departamento de Patología, Centro Nacional de Investigación Clínica para Trastornos Geriátricos, Hospital Xiangya de la Universidad Central Sur, Changsha, Hunan, China

Li Zhou

Departamento de Medicina, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, EE. UU.

Xin Fang Yu

Departamento de Radiología, Tercer Hospital Xiangya de la Universidad Central Sur, Changsha, Hunan, China

wei li

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Concepción y diseño: HDL, WL, XFY, HLZ, LZ; Desarrollo de metodología: HDL, WL, XFY, HLZ, LZ, QG, XYH, CW, LJL, JW; Adquisición de datos: HDL, WL, XFY, HLZ, LZ, QG, XYH, CW, LJL, JW; Análisis e interpretación de datos: HDL, WL, XFY; Redacción, revisión y/o revisión del manuscrito: HDL, WL, XFY; Soporte administrativo, técnico o material: HDL, WL, XFY, HLZ, LZ, LJL, JW; Supervisión del estudio: HDL, WL, XFY Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Wei Li o Haidan Liu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Georgios Giamas y Christina Karlsson-Rosenthal. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Zhou, H., Zhou, L., Guan, Q. et al. La degradación de MLKL mediada por Skp2 confiere resistencia al cisplatino en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas. Común Biol 6, 805 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05166-6

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Recibido: 29 de septiembre de 2022

Aceptado: 24 de julio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05166-6

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